光學顯微鏡的組織學樣品制備
概述
組織學是一個術語，指的是組織和細胞的微觀解剖學研究。正確的光學顯微鏡組織學樣品制備對于從組織樣品中獲得高質量結果至關重要。
幾乎所有組織學程序共有3個主要步驟。shou先，固定樣品，以保護組織并減緩組織降解。接下來，將樣品浸入具有與其自身相似的機械性能的材料或包埋介質中。包埋后，使用稱為切片機的精密切割工具將樣品切成薄片或切成薄片。該視頻介紹了這些常規步驟以及與之相關的一些概念。
組織樣本固定
組織固定是保存細胞和組織成分并維持其結構的關鍵步驟。細胞死亡后，天然存在的酶從細胞器中釋放出來，并開始降解整個細胞和細胞外基質中的蛋白質，從而破壞了細胞的結構。固定通過直接抑制這些酶消化蛋白質的能力和使酶切位點無法識別來防止這種降解。
固定的兩個主要機制是交聯和凝結。交聯涉及蛋白質內部以及蛋白質之間的共價鍵形成，這會導致組織變硬并因此抵抗降解。凝結是由于使用酒精或丙酮使蛋白質脫水而引起的，這會使蛋白質的三級結構變形，從而使疏水或擔心水的區域移動蛋白質表面。凝結性固定可以幫助包埋石蠟等介質穿透組織。
zui常用的固定劑之一是福爾馬林，它是溶于水中的甲醛。在固定過程中，甲醛附著在伯胺上，例如在賴氨酸和谷氨酰胺氨基酸側鏈上發現的那些，形成穩定的交聯鍵，稱為甲苯橋。此過程本質上很慢，zui多可能需要1-2天。
固定之前，應考慮一些注意事項。shou先，考慮樣品的擴散率。固定劑將以與固定劑的擴散系數乘以時間平方根相關的速率在組織中擴散一定距離。固定劑需要1個小時才能穿透1毫米到樣品中，將花費25個小時才能穿透5毫米。一旦福爾馬林到達組織中心，就需要發生交聯反應基石。因此，為了在合理的時間內徹底固定樣品，樣品的厚度應限制為4 mm。
其次，考慮固定劑的體積和pH值。固定劑與樣品的體積比應至少為40：1，以使試劑不會隨時間流逝。盡管某些固定劑的設計目的是在酸性pH值下工作，但福爾馬林在磷酸鹽緩沖液中保持中性pH值時效果zui佳，因此不會產生過多的酸，從而在組織中造成假象。
嵌入和分段
組織學準備工作的下一步是嵌入，這涉及到在具有與標本本身相似的機械剛度的介質中支撐標本。選擇正確的嵌入介質至關重要，因為如果它太硬或太弱，在切片時可能會出現缺陷。到目前為止，zui常用于包埋的介質是石蠟。
在石蠟包埋之前，必須先通過用乙醇代替組織中的水使樣品脫水，然后再用二甲苯和二甲苯，zui后加熱石蠟。蠟滲入樣品后，將其小心放置并使用模具將其包圍以形成塊。接下來，將樣品附著到組織盒上進行切片。
切片是從嵌入塊中切割樣品薄片的過程。切片通常為4-10 µm厚，可用于光學顯微鏡。
要切割切片，shou先將金屬，玻璃或金剛石刀片固定在切片機上。然后將樣品放在樣品架中。接下來，將樣品推進到切割表面并在刀片上拉出，以形成所需厚度的切片。切片將積聚成薄帶，可以放在載玻片上。
切片后，將樣品放在載玻片上。對于石蠟包埋的樣品，shou先將切片放入溫水浴中，然后將其從水中提起至載玻片上，然后干燥。
應用
生物組織的固有對比度很小，因此在組織學檢查后，玻片通常會用??突出形態或特定蛋白質的染料或抗體染色。進行的zui常見的染色是蘇木精和曙紅或H＆E。因為它是如此普遍，所以已經制造出許多自動機器，用H＆E對許多部分進行可重復染色。蘇木精將細胞核染成藍色，曙紅將細胞質染成粉紅色，顯示出組織的細胞形態。
固定的一個缺點是蛋白質的交聯可以使其更多地用于標記抗體以找到其結合位點?？梢允褂媒M織的快速冷凍或速凍，而不是使用固定來保存樣品，然后使用稱為冷凍切片的切片技術
將組織樣品包埋并定向在稱為OCT的特殊冷凍介質（或zui佳切割溫度介質）中，然后快速冷凍。像其他嵌入介質一樣，OCT與樣品的剛度匹配。
冷凍切片機或低溫恒溫器用于切割冷凍切片，并且該儀器將內部溫度保持在-20°C，以使切割刀片和樣品保持涼爽。與石蠟包埋的切片相比，切片后可以將冷凍切片直接直接舉到帶正電的載玻片上。
避免固定的另一種方法是通過瓊脂包埋，即用新鮮制備的液體瓊脂糖覆蓋樣品。當瓊脂糖冷卻時，它將組織鎖定在適當的位置，多余的瓊脂糖可以修剪掉。
切片機是切片機的另一種選擇，它具有一個刀片，可以振動并在瓊脂糖包埋的樣品上移動。切片刀用于從瓊脂糖包埋的樣品中產生約50-1000 µm的厚切片。
通常在染色前將樣品從瓊脂糖中取出，然后放在載有諸如真空油脂等物質包圍的載玻片上，以防止蓋玻片擠壓樣品。zui好使用共聚焦顯微鏡對其進行觀察，以獲得每個厚切片的高分辨率圖像。
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